Новоспасский монастырь стал местом погребения московской знати (прежде всего, бояр Романовых) во второй половине XV века, почти сразу после перенесения обители великим князем Иоанном III на Васильевский стан.
Среди погребенных в подклете Спасо-Преображенского собора - основоположник царского дома Роман Юрьевич Захарьин (t 1543), великая государыня Марфа Иоанновна (t 163I) и боярин Никита Романович Юрьев (в схиме Нифонт, t 1586), отец Патриарха Филарета. В древней части усыпальницы находились захоронения четырех родных братьев Патриарха Филарета. Трое из них, попавшие в опалу при Борисе Годунове, умерли в северных ссылках, а в 1607 году были перезахоронены в Новоспасском монастыре.


Помимо Романовых, в обители нашли последнее упокоение представители древних родов Черкасских, Дашковых, Голицыных, Куракиных, Новосильцовых и других. Здесь покоятся иерархи Русской Православной Церкви и настоятели монастыря - в частности, исследователь и описатель христианского Востока епископ Порфирий (Успенский). Неподалеку был похоронен настоятель Новоспасского монастыря епископ Петр (Екатериновский), прославившийся на литературной ниве. Сюда, в усыпальницу уже восстановленного монастыря, в 1995 году были торжественно перенесены останки великого князя Сергея Александровича. Пятый сын Александра II погиб от руки эсера Каляева в 1905 году, будучи генерал-губернатором Москвы.


Здесь же находится захоронение княжны Августы Таракановой, дочери императрицы Елизаветы Петровны. В результате дворцовых интриг в 1785 году княжну Тараканову насильно заточили в московский Иоанновский монастырь. Пользуясь духовным покровительством митрополита Платона, княжна не только преодолела все тяготы своего затворничества, но и приобрела истинно христианский взгляд на жизнь.
Она стала известной инокиней Досифеей - необыкновенной молитвенницей, духоносной старицей. Известно, что инокиня Досифея подвигла на монашеский путь будущего оптинского старца схиархимандрита Моисея. Проведя 25 лет в подвигах духовной жизни, она скончалась в 1810 году. В память о посещении обители в 1900 году царской четой в усыпальнице сооружен храм во имя преподобного Романа Сладкопевца - небесного покровителя рода Романовых. Освятил храм в 1902 году митрополит Московский и Коломенский Владимир (Богоявленский), прославленный спустя 90 лет в лике священномучеников.



В XX веке усыпальница Новоспасского монастыря подверглась небывалому надругательству и беспощадному разорению: почти все захоронения были вскрыты, надгробия уничтожены, от убранства церкви не осталось и следа. Часть пропавшего удалось отыскать. В конце 1990-х годов усыпальницу Романовых восстановили. Воссоздан и храм преподобного Романа Сладкопевца, его освящение 10 марта 2002 года совершил Святейший Патриарх Московский и всея Руси Алексий II.